最近高分辨率成像技術(shù)的發(fā)展使研究人員能夠通過使用免疫熒光染色在其感興趣的細(xì)胞和組織中可視化亞微米級甚至納米級結(jié)構(gòu)。然而，這需要在樣品制備過程中進行仔細(xì)對步驟進行優(yōu)化，以便獲得清晰的圖像，并且隨著圖像分辨率的提高，方案可能會變得更加苛刻。

　　盡管各種抗體制造商都提供了“最佳”方案，但遺憾的是沒有可應(yīng)用于所有樣品類型的標(biāo)準(zhǔn)程序。事實上，大多數(shù)時候，研究人員需要通過反復(fù)試驗找到最佳工作流程。

　　理論上，免疫熒光染色方案包括以下六個基本步驟：固定-透化-封閉-一抗孵育-二抗孵育以及圖像采集。然而，在每一步都有許多小細(xì)節(jié)：當(dāng)以一種或另一種方式完成時，可決定您是否獲得良好的免疫熒光圖像或糟糕的圖像。

　　來自 Lewis 大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用抗兔 PCNA 抗體（以洋紅色顯示）、抗 α-微管蛋白抗體（以綠色顯示）和鬼筆環(huán)肽（以紅熱顯示）染色。使用 Leica SP8 共聚焦顯微鏡獲取圖像。

　　自2017年作為理學(xué)碩士學(xué)生進入研究環(huán)境以來，我一直在研究各種類型的間充質(zhì)干細(xì)胞和胚胎組織，研究顱面再生和發(fā)育。此外，我一直沉浸在免疫熒光染色的世界中，拍攝了無數(shù)圖像，包括我的第一篇出版物（Yamada et al., 2019）《牙科研究雜志》的封面藝術(shù)。在每年花費近300小時進行熒光成像后，我發(fā)現(xiàn)了適合我的細(xì)胞和應(yīng)用的完美免疫熒光方案。我了解到，這里和那里的一些小調(diào)整真的會有所作為！

　　在本文中，我將分享我的前5個基本但經(jīng)常被忽視的優(yōu)化步驟，這些步驟將改善您的免疫熒光細(xì)胞圖像。

　　1. 了解您的目標(biāo)蛋白并確定固定方案

　　首先要考慮的關(guān)鍵因素是決定為您的樣品使用哪種固定劑。各種固定劑，包括醛類（例如，多聚甲醛：PFA）、酒精（例如，冰冷的甲醇）和酸基溶液（例如，三氯乙酸）已顯示出與免疫熒光出色的相容性，但是這些固定劑中的每一種都有其優(yōu)點和缺點。PFA和甲醇是很好的選擇。您可以在文獻中了解它們在固定特性方面的差異（例如Eldred et al., 1983）。

　　無論您選擇哪種固定劑，優(yōu)化固定時間至關(guān)重要。應(yīng)避免過度固定，因為它會對細(xì)胞造成破壞性影響并惡化抗體識別（圖 1A）。然而，人們也應(yīng)該避免固定不足，因為它允許您的靶向蛋白質(zhì)從其天然位點移動并擴散到“外部世界”。這不僅會導(dǎo)致模糊圖像，還會導(dǎo)致假陽性染色。

　　時間很重要，溫度同樣也很重要。低溫使反應(yīng)緩慢且對細(xì)胞的破壞性較小，但它可能使蛋白質(zhì)有時候在被固定之前四處移動。通常，當(dāng)使用強效/速效固定劑（如冰冷的甲醇）時，優(yōu)選在低溫下固定。對于較溫和的固定劑，如PFA，在環(huán)境溫度下固定可能更合適，至少對于單層細(xì)胞。

　　我曾經(jīng)盲目地遵循“4% PFA 室溫 15 分鐘”的規(guī)則，但后來我發(fā)現(xiàn)我的樣品固定不足，浪費了很多時間和資源。這可能不會經(jīng)常發(fā)生，但它會發(fā)生。如有疑問，請仔細(xì)檢查您的固定方案！

　　圖 1A：過度固定的示例。甲醇在室溫下使用 15 分鐘。紅色和細(xì)胞核中的 α-微管蛋白，藍(lán)色的 DAPI 

       圖 1B：正確固定細(xì)胞的示例：-20 度冰冷的甲醇 5 分鐘。紅色的α-微管蛋白和藍(lán)色的細(xì)胞核 *DAPI

　　2. 確定使用哪種洗滌劑以及何時使用（或不使用）

　　當(dāng)需要透化時，非離子去污劑（例如，Triton X-100 和 Tween-20）通常不僅包含在透化緩沖液中，而且還經(jīng)常包含在封閉緩沖液、洗滌緩沖液和染色緩沖液中。這是因為去污劑的使用實際上提高了封閉效率，并在洗滌步驟中去除了非特異性抗體結(jié)合。但是，如果您的靶向蛋白（尤其是在細(xì)胞膜或細(xì)胞骨架上）在您的圖像中顯示的數(shù)量低于您的預(yù)期，則洗滌劑可能會干擾免疫染色。

　　Triton X-100 和 Tween-20 具有不同的化學(xué)特性，但最重要的是，Triton X-100 比 Tween-20 更強大地滲透細(xì)胞膜。如果在透化步驟中使用 Triton X-100，您可以選擇是繼續(xù)在洗滌、封閉和染色緩沖液中使用 Triton X-100，還是改用 Tween-20，甚至繼續(xù)沒有任何清潔劑。或者，您可能只想使用 Tween-20 進行滲透。最后，不要忘記有時您根本不需要清潔劑。

　　3. 濃度低，但孵化時間長

　　使用最少量的抗體對于提高信背比極為重要。我總是建議使用抗體滴定來確定最低工作濃度，即使制造商可能會提出最佳濃度。通常，與高抗體劑量的較短孵育時間相比，低抗體濃度的較長孵育時間（例如，4°C，過夜）提供更清晰、更強和更特異性的染色模式。抗體滴定有時很費力，需要額外的資源和時間，但一旦確定了最佳工作濃度，您就不會后悔。

　　4. 洗 洗 洗

　　洗滌可能是免疫熒光染色過程中最重要的步驟。相信我，一個人永遠(yuǎn)不會后悔額外的洗滌步驟！只要使用高質(zhì)量的抗體，抗原-抗體結(jié)合就足夠強，可以承受“額外的”洗滌步驟，同時有效去除弱結(jié)合或非特異性結(jié)合的抗體。一個微弱的低語可能即將從你的嘴唇中發(fā)出，“它既費時又單調(diào)。”我知道，但洗滌確實讓您的形象從好到更好！多增加一兩個洗滌步驟，讓您有時間享用一杯茶。

　　5. 找到合適的光學(xué)設(shè)備

　　最后但并非最不重要的一點是，只有在所有光學(xué)系統(tǒng)都得到很好的優(yōu)化后，才能捕捉到圖像中的精細(xì)細(xì)節(jié)。如果您從事攝影，您可能會意識到高端鏡頭通常比相機（例如傳感器系統(tǒng)）本身更昂貴。這僅僅是因為在精密玻璃和涂層的開發(fā)上花費了如此多的資源和如此多的時間。可以說，這些鏡頭的質(zhì)量決定了圖像的質(zhì)量。同樣的理論也適用于微觀系統(tǒng)。顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)是最終圖像質(zhì)量的關(guān)鍵決定因素。有趣的事實：這是顯微鏡制造商為了提升他們的技術(shù)而激烈競爭的組件！

　　現(xiàn)在我能聽到你說，“我們不能改變顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。”實際上，您可以更改某些東西，這將極大地影響成像結(jié)果，而與您的技術(shù)設(shè)備無關(guān)：用于培養(yǎng)或放置細(xì)胞和樣品的蓋玻片或成像室！這些由薄玻璃或塑料制成的組件對人眼是完全透明的，但它們中的每一個：光/激光通過的地方，都會顯著影響最終的成像結(jié)果，就像它們是光學(xué)系統(tǒng)的一部分一樣。

　　這就是 ibidi μ-Slides 發(fā)揮作用的地方！ ibidi μ-Slide 腔室和蓋玻片的開發(fā)具有出色的光學(xué)質(zhì)量，適用于高分辨率顯微鏡，因為它們的蓋玻片底部很薄。對于細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)高分辨率成像（例如，相差、共焦或 2 光子），強烈建議使用細(xì)胞培養(yǎng)處理 (ibiTreat) polymer版，其 No. 1.5蓋玻片厚度為 180 μm，而 μ-Slides #1.5H 玻璃底部 (170 μm +/-5 μm) 的載玻片非常適合 TIRF 和超分辨率顯微鏡應(yīng)用。

　　在我的博士項目開始時，ibidi μ-Slides被介紹給了我，從那時起我就一直在使用它們進行 IF 實驗。如果您以前從未使用過它們，我建議您嘗試一下！